Rotavirus

Situación global

El rotavirus es la causa individual más importante de enfermedad diarreica severa en niños pequeños en todo el mundo. Cada año el rotavirus causa 111 millones de casos de diarreas que solo requieren atención en el hogar, 25 millones que requieren consulta médica y 2 millones de hospitalizaciones (Parashar, 2003) (Fig 1).

Recientemente se ha recalculado la mortalidad global considerando el aumento en la proporción de diarreas severas causadas por rotavirus obteniéndose un estimado de 611.000 (rango 454.000-705.000) muertes anuales asociadas a rotavirus (Parashar, 2006). El mismo estudio encontró que el 39% de las hospitalizaciones por diarrea en niños menores de 5 años son causadas por rotavirus con muy ligeras diferencias entre países de distinto nivel de ingreso per cápita. Se puede decir que, virtualmente, cada niño nacido habrá sufrido una infección por rotavirus cuando alcanza los tres años de vida. En una visión global, 1 en 5 requerirá visita clínica, 1 en 65 requerirá hospitalización y aproximadamente 1 en 293 morirá (Fig 1).

Estos agentes afectan por igual a todos los niveles socio-económicos y la incidencia de morbilidad es similar en países desarrollados o en desarrollo, sin embargo las altas tasas de mortalidad asociadas a inadecuada o tardía atención médica, desnutrición y pobres condiciones sanitarias son características de los países subdesarrollados y el 82% de las fatalidades antedichas acontecen en los países más pobres.

La demostración de anticuerpos séricos en más del 90% de la población a los tres años de vida es una prueba de la amplia diseminación de la infección en todos los países y niveles socioeconómicos. En estudios de varios años llevados a cabo en diversos países sobre la incidencia del rotavirus en diarreas provenientes de niños hospitalizados, para la franja de los 6 a los 24 meses, la misma oscila entre el 35 y el 55%, mientras que disminuye en niños por debajo de los seis meses y para la franja etaria entre los cinco y trece años. El fenómeno se observa tanto en países desarrollados como subdesarrollados aunque en estos últimos la diarrea severa por bacterias y en particular por las cepas enterotoxigénicas de E. coli se vuelven cuantitativamente más significativas. En algunos estudios se resalta la mayor tendencia de los rotavirus a producir deshidratación cuando se los compara con cualquiera de los otros agentes involucrados en la producción de diarreas ya sean bacterias, parásitos o agentes indeterminados (Kapikian, 2001).

Las infecciones intrahospitalarias son frecuentes como ha sido demostrado en varios estudios donde un porcentaje significativo de los niños internados por otras patologías desarrollan diarreas por rotavirus en los períodos de alta prevalencia estacional. En el período neonatal tambien es posible demostrar excreción viral aunque en estos casos la infección es casi siempre asintomática. En cuanto a los adultos, las reinfecciones por el rotavirus del grupo A son muy comunes aunque la manifestación como gastroenteritis muy rara. La evidencia se obtuvo de contactos adultos de niños cursando diarreas en los cuales es posible detectar en más de la mitad de los casos elevaciones del nivel de anticuerpos específicos. También hay reportes de brotes en geriátricos, en personal hospitalario y en reclutas pero no son eventos frecuentes muy probablemente por la inmunidad adquirida en infecciones previas (Kapikian, 2001).

Transmisión:

Se acepta que la transmisión es, en la gran mayoría de los casos, por la ruta fecal-oral. El contagio se produce normalmente a partir de un hermano mayor o adulto con infección asintomática. Aún se discute la posibilidad de la ruta respiratoria ya que existe cierta evidencia que la avalaría (Kapikian, 2001). La resistencia a las condiciones ambientales de la partícula viral, su capacidad para sobrevivir sobre superficies bajo diferentes condiciones y el gran número de viriones que son excretados en heces contribuyen a su amplia diseminación (Abad, 1994). Estas características son responsables de la persistencia de la infección por rotavirus descripta en algunos servicios neonatales y de la alta frecuencia de infecciones intrahospitalarias observadas. La alta humedad relativa (aprox. 80%) resulta en una rápida pérdida de infectividad del rotavirus humano. Aunque se ha detectado rotavirus en aguas residuales, se considera poco probable que el agua contaminada juegue un rol muy importante en la diseminación (Kapikian, 2001).

El hecho de que muchos de los antígenos de neutralización de las cepas de rotavirus humanos del grupo A se hayan encontrado también en animales y la posibilidad de que algunas cepas animales puedan infectar humanos y viceversa ha hecho que se considere a la transmisión interespecie y la subsecuente reasociación de segmentos genómicos una de las fuerzas impulsoras de la evolución de estos virus. La infección de humanos a partir de animales sería un evento más bien raro aunque en algunas zonas geográficas restringidas, cepas originadas de la reasociación humano-animal pueden ser muy prevalentes como las humano-bovino de la India y las humano-cerdo de Brasil (Das, 1993; Gouvea, 1994).

Situación en la Argentina

Incidencia:
En un estudio reciente basado en estadísticas del Ministerio de Salud de la Nación y en varios estudios previos sobre la incidencia del rotavirus en la enfermedad diarreica se estimó que para el año 1999 de las 248 muertes de niños menores de tres años causadas por diarreas severas con causa infecciosa no definida, 99 (40%) fueron causadas por el rotavirus (Gómez, 2002). Los autores estiman, en forma conservadora, que de 658.735 niños nacidos en 1995, uno de cada 2 (367.000) requirió atención médica, uno de cada 12 (55.694) fue hospitalizado y uno de cada 1.599 (411) murieron por causa de enfermedad diarreica antes del quinto año de vida. De forma similar estiman que uno de cada 6 (110.100), uno de cada 35 (18.769) y uno de cada 4.169 (158) de esos niños requirieron atención médica, fueron hospitalizados o murieron, respectivamente, a causa del rotavirus antes de su tercer año de vida (Gómez, 2002). Durante Octubre de 1996 y Octubre de 1998 un programa de vigilancia nacional fue organizado para la detección y tipificación de rotavirus en nueve ciudades importantes de la Argentina detectándose el rotavirus en un 42% del total de diarreas requiriendo hospitalización en niños menores de tres años (Bok, 2001). Es importante hacer notar que durante el estudio multicentrico el 3,8% de todas las internaciones pediátricas fueron por la diarrea causada por rotavirus del grupo A y, por otro lado, que no se hallaron diferencias significativas en cuanto a incidencia o estacionalidad de la infección entre las distintas unidades centinela ubicadas en siete ciudades: Buenos Aires, La Plata, Mar del Plata, Córdoba, Tucumán, Rosario y Mendoza (Bok, 1999).

Estacionalidad:
En varios estudios se demostró una distribución estacional de la frecuencia con un pico durante los meses fríos, desde el otoño tardío (mayo) hasta julio, pero con casos durante todo el año (Grinstein, 1989; Gómez, 1986). La estacionalidad fue reanalizada en estudios más recientes que indican un aumento continuo de la incidencia de las diarreas por rotavirus desde Enero alcanzando un máximo en mayo. Durante el pico centrado en este mes hasta un 64% de las diarreas estudiadas a través de una red de vigilancia nacional fueron positivas para rotavirus mientras que en el resto del año las frecuencias halladas van desde un 6 a un 21% (Bok, 1999).

Edades afectadas:
La diarrea por rotavirus del grupo A afecta principalmente a niños entre los 6 y 24 meses en todo el mundo. En la argentina la incidencia parece ser muy importante durante el primer año de vida ya que en varios estudios, alrededor del 80% del total se registra durante este período con un 35% ya a los seis meses de edad (Gomez, 1998). El estudio multicéntrico llevado a cabo entre Octubre de 1996 y Octubre de 1998 en varias ciudades importantes del norte y centro del país halló los siguientes promedios acumulativos: 26% en niños hasta los seis meses, 62% al año y 92% hacia el segundo año de vida (Bok, 2001).

Consecuencias económicas:
En cuanto a la importancia económica de la patología, en el estudio de revisión de Gómez y colaboradores, utilizando datos nacionales del año 1991se ha estimado que las hospitalizaciones asociadas a diarrea por rotavirus alcanzan las 21.000 anuales, mientras que las consultas médicas por la misma causa son unas 84.500 al año. En ese estudio se estimó que los gastos derivados se elevarían a unos 27 millones de dólares anuales (Gomez, 1998).

Los rotavirus integran uno de los nueve géneros dentro de la familia Reoviridae, sus miembros comparten una morfología de virión casi esférica, de un diámetro de 75 nm, tienen tres cubiertas proteicas sin envoltura lipídica a las cuales nos referiremos como cápside externa, cápside interna y core (Fig.2) El genoma consiste de RNA de doble cadena lineal dividido en 11 segmentos contenidos en el core viral. Este genoma codifica 12 proteínas: seis estructurales, incluidas en la partícula viral y denominadas VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 y VP7 y seis proteínas no estructurales expresadas solo en la célula infectada y denominadas NSP1 a 6. Las proteínas más importantes desde el punto de vista inmunológico y por lo tanto para el desarrollo de vacunas son las estructurales VP4, VP6, VP7 y la no estructural NSP4 (enterotoxina viral).

Clasificación:

Los rotavirus son clasificados desde un punto de vista inmunológico en siete serogrupos con base, fundamentalmente, en las características antigénicas de la proteína VP6. Esta proteína es la mayoritaria en el virión, forma la cápside interna (en azul en la Fig. 2) y es altamente inmunogénica pero los anticuerpos que induce no son neutralizantes. Se han identificado siete grupos denominados A a G, siendo el grupo A, por mucho, el más importante agente etiológico de las diarreas en niños pequeños, aunque también miembros de los grupos B y C se han identificado en diarreas en humanos. Dentro del grupo A, pueden diferenciarse 4 subgrupos por diferencias en la VP6 (I, II, I+II y noI, noII) aunque la identificación de subgrupos se utiliza cada vez menos en los estudios epidemiológicos. El grupo B ha sido identificado como el causante de importantes brotes de gastroenteritis en niños y adultos pero, por el momento, parece estar restringido a China y La India. Los rotavirus del grupo C se identifican regularmente en brotes escolares y familiares y casos esporádicos en todo el mundo. Estudios de seroprevalencia y detección del grupo C en diarreas en nuestro país, han identificado una edad de adquisición más tardía con respecto al grupo A (Castello, 2000; Castello 2002). Es importante resaltar el hecho de que, dadas las importantes diferencias antigénicas, los métodos comerciales de detección no son capaces de detectar a los rotavirus no-grupo A por lo que casi la totalidad de los datos epidemiológicos a nivel global se refieren a los rotavirus grupo A. En adelante nos referiremos exclusivamente a éstos ya que, como se mencionó previamente, son los agentes más importantes de enfermedad severa en niños menores de tres años y todos los esfuerzos para el desarrollo de vacunas se enfocan en éste grupo.

Las proteínas de cápside externa VP4 y VP7 (Fig. 3) inducen la producción de anticuerpos neutralizantes y, por lo tanto, han dado base al sistema dual de clasificación en serotipos. Dado que la VP7 es una glicoproteína, los serotipos definidos por la misma se denominan G y por las características de sensibilidad a proteasas de la VP4, estos serotipos se denominan P. Los serotipos son definidos por ensayos de neutralización o de reducción de focos de fluorescencia usando sueros hiperinmunes contra cepas de referencia (Estes, 2001).

Serotipos y genotipos de los rotavirus del grupo A

Estos agentes han sido detectados en la mayoría de las especies de animales domésticos y en muchas especies de mamíferos salvajes y aves. Cuando se analizan gran cantidad de secuencias amnoacídicas de las proteínas VP4 y VP7 se hallan divergencias mas o menos localizadas en ciertas “zonas calientes”. En general, las cepas de rotavirus que comparten más de un 89% de identidad de secuencia aminoacídica en la proteína VP4 se consideran como pertenecientes al mismo genotipo P y el mismo nivel de identidad en la proteína VP7 asigna la pertenencia al genotipo G. Se han descrito 15 genotipos G y 26 genotipos P (Martella, 2005). Existe una correlación importante entre genotipo y serotipo, y, en teoría, cada genotipo se correspondería con la existencia de una variante serotípica o, al menos, sub-serotípica. Esto se demuestra para prácticamente todos los tipos G pero no para los tipos P para los cuales sólo 14 serotipos P fueron formalmente demostrados y la correlación no es absoluta con genotipos. Como consecuencia de esto, se adopta un sistema de numeración coincidente para serotipo y genotipo G pero no para los tipos P para los cuales los serotipos se denominan con la P seguida de un número para tipo (y una letra para subtipo cuando corresponda) y los genotipos con la P y el número entre corchetes. De la diversidad genética total hallada hasta el presente en los rotavirus grupo A provenientes de distintas especies, once genotipos G (G1-6, 8-12) y doce genotipos P (1, 3-6, 8-11, 14, 19, 25) han sido al menos una vez demostrados en el humano (Martella, 2005; Rahman, 2005). De éstos, solo cinco tipos G y tres tipos P representan más del 90% de las cepas relevadas en la última revisión global (Santos, 2005).

Metodología: Los rotavirus son los únicos agentes conocidos de mamíferos o aves que contienen once segmentos de RNA de doble cadena y el análisis de la distribución de los mismos en corridas electroforéticas en geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata es una técnica que ha sido ampliamente usada con fines de detección y en estudios epidemiológicos (electroferotipo, PAGE). Otra técnica usada para el estudio epidemiológico es el genoagrupado ( genogrouping) el cual consiste en una combinación de hibridación de ácidos nucleicos y corrida en geles de poliacrilamida y permite evidenciar relaciones de homología entre segmentos genómicos de distintas cepas.

La coinfección de una célula en un organismo o en cultivo por dos cepas diferentes puede generar progenie viral con individuos conteniendo segmentos de ambas cepas parentales, es decir, reasociantes ( reassortants). El genoagrupado ha sido útil para clasificar a los rotavirus en grupos que comparten gran homología (genogrupos) y para identificar el origen de segmentos específicos de RNA en virus reasociantes, por ejemplo aquellos involucrados en transmisión ínter-especies. El genoagrupado permitió individualizar las tres familias o genogrupos principales de rotavirus humanos: Wa like, DS-1 like y AU-1 like. Actualmente, se utiliza el electroferotipado (PAGE) y el genoagrupado para el seguimiento de la diseminación de cepas específicas y el estudio de reasociantes respectivamente, temas que dejaremos fuera de esta discusión. Baste decir que el hecho de que los rotavirus pueden sufrir reasociación de segmentos in vivo y la comprobación de reasociación independiente de los genes responsable, por ejemplo, de la especificidad serotípica implica que el complemento genético total de un aislado en particular no puede ser asumido a priori. Es decir que si bien se observan combinaciones G/P típicas en cada especie también se ha documentado la circulación de cepas reasociantes con combinaciones humanas infrecuentes o con segmentos genómicos adquiridos de cepas animales.

A los fines de determinar los serotipos circulantes en una región determinada, lo cual se hace imprescindible para el estudio de la evolución viral, su interacción con los huéspedes y para el diseño y monitoreo de planes de vacunación, se han utilizado técnicas de neutralización, inmunoquímicas y moleculares. Hasta mediados de los 90’s se aplicaron más frecuentemente técnicas inmunológicas, detectándose generalmente los serotipos G por ELISA con anticuerpos monoclonales. Esas técnicas han sido reemplazadas casi totalmente por la tipificación o, más estrictamente, la genotipificación por RT-PCR. Esto fue impulsado por varias desventajas del ELISA de tipificación (necesidad de usar varios monoclonales para cada serotipo G para cubrir variantes intratípicas, ausencia de un suministro adecuado de anticuerpos confiables anti-tipos P) y la mayor confiabilidad y adaptabilidad de la RT-PCR para este uso particular.

Hallazgos de los estudios de caracterización de cepas circulantes

Situación global:
En la revisión global más reciente de estudios de tipificación, Santos y Hoshino describen la distribución temporal y geográfica de los tipos P y G revisando estudios de 52 países en cinco continentes con muestras colectadas entre 1973 y 2003. Las combinaciones de los tipos G1, G2, G3 y G4 con los tipos P[8] y [4], previamente individualizados como los tipos humanos más comunes, representaron más del 88% de las cepas en todo el mundo. Adicionalmente, el tipo G9 con P[8] o P[6] ha emergido como el cuarto tipo G en frecuencia con un porcentaje del 4,1%. Sin embargo, cuando los resultados se desglosan, aparecen particularidades características de cada continente, subcontinente o región. Por ejemplo, las cepas P[8]G1 representan más del 70% en Norteamérica, Europa y Australia pero solo el 30% en Sudamérica y tipos poco frecuentes pueden ser importantes regionalmente como las G8 en Africa y las G5 en Brasil (Santos, 2005). En la figura 4, por ejemplo, se comparan los porcentajes de las distintas combinaciones G/P hallados globalmente con los de Sudamérica. Dos particularidades a resaltar son que el tipo G9 resulta más prevalente en el subcontinente que el tipo G3 y que el tipo G5 ha sido detectado en Brasil desde 1982 y con alta frecuencia en Río de Janeiro hasta 1997. Estos tipos no han sido incluidos por el momento en las formulaciones de vacunas en condiciones de ser licenciadas.

En la representación de frecuencias de la Fig. 4 se excluyen las infecciones mixtas y cepas no tipificables, dos categorías muy importantes en la epidemiología de nuestra región. En otra revisión reciente en la cual se incluyen estudios de tipificación G y P por RT-PCR en países latinoamericanos entre 1995 y 2004, un 12% (rango 0-44%) fueron infecciones mixtas y un 20% (rango 0-67%) resultaron no tipificables. En la figura 5 se incluyen estas categorías y algunas de las cepas inusuales para obtener una representación más acabada de la complejidad real. Otros hallazgos de interés son la importante cantidad de cepas originadas posiblemente por reasociación con rotavirus animales como las ya mencionadas G5 (porcina), pero tambien G8, G10 y P[1] típicamente bovinas y P[9] importante en felinos y perros. Adicionalmente, los datos describen el incremento de cepas G9 y la emergencia del serotipo infrecuente G12 en Argentina (Castello, 2004).

Tipificación de cepas de rotavirus en la Argentina

Métodos de detección:
Los rotavirus fueron detectados por primera vez en el país por microscopía electrónica (ME) sobre muestras de diarreas (Lombardi, 1975), posteriormente otros estudios pioneros utilizaron también la ME y la contrainmunoelectroforesis con anticuerpos policlonales (Muchinik, 1980a; Muchinik, 1980b). Posteriormente, los datos epidemiológicos fueron derivados de estudios que utilizaron distintos tipos de enzimonmunoensayos (EIAs), aglutinación de partículas de latex sensibilizadas con anticuerpos o por la utilización de la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) de extractos del dsRNA viral, que aunque de menor sensibilidad que la mayoría de los EIAs tiene la ventaja de reconocer la presencia de los rotavirus no-grupo A y otros agentes más raros. La excreción de partículas virales es, usualmente, muy alta en heces durante una infección, por esto los métodos de ELISA, látex o PAGE son herramientas adecuadas para el diagnóstico rutinario. Sin embargo cuando las muestras son tomadas en una etapa tardía de la infección o cuando se desea buscar el agente en muestras distintas de materia fecal como hisopados faríngeos, líquido cefalorraquídeo o secreciones respiratorias, donde la cantidad de virus es normalmente muy baja, son necesarios métodos más sensibles como la
RT-PCR (Hussain, 1995; Argüelles, 2000).

Métodos de caracterización de cepas circulantes:
Desde los primeros estudios en los ochentas la variabilidad de las cepas circulantes fue estudiada por varios métodos que incluyen PAGE, caracterización del serotipo por EIA y, más recientemente genotipificación por RT-PCR. Los tipos G y P presentes en distintas regiones del país y sus frecuencias relativas fueron estudiados en varias regiones y ciudades incluyendo zonas del norte (Tucumán, Chaco, Misiones), centro (Córdoba, Mendoza, Buenos Aires, Santa Fé) y recientemente el extremo sur analizando muestras de Ushuaia. Uno de los métodos utilizados para la caracterización de cepas fueron los enzimo-inmunoensayos basados en anticuerpos monoclonales tipo-específicos que reconocen los serotipos VP7 G1, G2, G3 y G4 (Taniguchi, 1987). El segundo método usado para estos estudios de epidemiología molecular fue la RT-PCR con primers tipo específicos para una mayor variedad de alelos del gen VP7 y también los del gen VP4, lo cual constituyó una sustancial mejora (Argüelles, 2000; Espul, 2000; Bok, 2001 a; Bok, 2001 b.).

Tipificación inmunológica del rotavirus del grupo A:
Desde 1990 se han llevado a cabo varios trabajos para determinar la prevalencia de los distintos serotipos G del rotavirus del grupo A. La técnica de ELISA basada en anticuerpos monoclonales fue aplicada a la caracterización de cepas en tres estudios a partir de muestras colectadas entre 1983 y 1992 en tres diferentes zonas geográficas: Buenos Aires (Gómez, 1990), Mendoza (Espul, 1993) y Tucumán (Castagnaro, 1994). En estos trabajos un 78% del total de muestras analizadas pudieron ser efectivamente tipificadas con los siguientes resultados globales: G1 60%, G2 20%, G4 14% y G3 5% con un 1% de cepas no G1-G4. De la comparación de prevalencias surge que, en Buenos Aires todos los serotipos fueron encontrados en cantidades apreciables mientras que en Mendoza 42 de las 43 cepas evaluadas fueron G1. Una posible explicación dada por los autores hace referencia al mayor intercambio poblacional y de viajeros de la primera ciudad con respecto a la segunda (Espul, 1993). Sin embargo, en un relevamiento más reciente de Mendoza utilizando varios anticuerpos monoclonales por serotipo se halló que de 137 especimenes tipificados, 68 (49,6%) reaccionaron específicamente para G1 y 48 (35%) para G2 aunque con diferentes patrones de reactividad con un panel de siete monoclonales anti-G1 y tres monoclonales anti-G2. Fue evidente una gran diversidad intratípica ya que dentro del genotipo G1 se obtuvieron 28 patrones de reactividad distintos. Los resultados derivados del EIA fueron confirmados por RT-PCR con primers genotipo (serotipo) G específicos (Espul, 2000).

Tipificación de los rotavirus del grupo A por RT-PCR:
Los resultados de varios trabajos dirigidos a explorar las frecuencias de los distintos genotipos de rotavirus del grupo A muestran que las especificidades usualmente encontradas a nivel global son también aquí las más comunes. De los diferentes estudios de genotipificación publicados llevados a cabo en todo el país surgen las siguientes frecuencias totales con muestras colectadas entre los años 1995 y 1998: 35,9% P[4]G2; 19,8% P[8]G1; 8,6% P[8]G4 y 5,1% P[4]G1 además de un 10% de infecciones mixtas por serotipos comunes (Argüelles, 2000; Espul, 2000; Bok, 2001 a) (Tabla 1). Un muestreo adicional que abarcó unidades centinela desde el extremo sur del país entre Septiembre de 1998 y Junio de 1999 sugiere la emergencia del genotipo G9 (Bok, 2001 b). Durante este primer período también es destacable la presencia de la combinación inusual P[4]G1 en frecuencias considerables y la identificación de dos cepas P[8]G5 en Santa Fe. Por otro lado la frecuencia combinada de las cepas que no pudieron ser tipificadas ya sea para la especificidad G o P suma un 17,9%. En particular, parte de las cepas no tipificables de nuestra colección fueron posteriormente identificadas como pertenecientes al serotipo G12 por estudios de secuenciamiento. Estas cepas fueron adaptadas a cultivo y caracterizadas molecularmente y se halló que eran del tipo P[9]G12 e indistinguibles de cepas asiáticas circulando en Corea, Japon y Tailandia (Castello, 2004 b).

Nuestro grupo ha continuado la vigilancia de cepas de rotavirus en áreas del conurbano bonaerense en forma ininterrumpida hasta el presente y, como se ha demostrado en otros escenarios, el comportamiento de las frecuencias de los tipos G y P es fluctuante (Fig. 6). Por ejemplo, posteriormente a los estudios antes mencionados, hemos establecido que en nuestra zona se ha registrado un aumento notable de la frecuencia de las cepas G4 convirtiéndose en las más prevalentes en el 2001 superando el ochenta por ciento de las muestras tipificadas. Un estudio filogenético fundamentaría este incremento en la introducción simultánea de dos o tres sublinajes de G4 en la Argentina hacia el año 1999 (Bok, 2002). En 2002 y 2003 el tipo G predominante fue G1 el cual nunca cayó por debajo del 10% entre 1996 al 2003. En resumen, los tipos dominantes entre 1999 y el 2003 fueron G1 (40%) y G4 (44%), el genotipo P[8], asociado normalmente con G1, G3, G4, o G9, fue identificado a frecuencias entre 64% y 90% durante los cinco años lo cual es consistente con la alta incidencia de G1 y G4. El genotipo P[4] (preferencialmente asociado con G2) fue detectado como cepa simple solo una vez. Es notable la virtual desaparición de G2 y P[4] en este período dada la alta frecuencia de estas cepas en el período 1996-1998 (Fig. 6). Por otro lado, las cepas G12 fueron detectadas cada año entre 1999 y 2002 y, dada su potencial importancia como una combinación novel de tipos G/P emergentes, su presencia en muestras más recientes está siendo evaluada.